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CCK8檢測細胞增殖毒性的方法
更新時間:2020-11-24 點擊量:2053
  CCK8試劑用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8【化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
 
  CCK8檢測細胞增殖/毒性的方法:
 
  1.將處于對數(shù)生長期的各實驗組細胞胰酶消化后,*培養(yǎng)基重懸成細胞懸液,并計數(shù)。
 
  2.根據(jù)細胞生長快慢決定鋪板細胞密度(多數(shù)為1000-2000 cell/well),每組3-5重復,每孔100-200μl培養(yǎng)基。根據(jù)實驗設計決定鋪板數(shù)量(如需要檢測5天,則鋪5張96孔板),我們以1000 cell/well,5復孔,200μl培養(yǎng)基,檢測5天為例,各實驗組需要細胞數(shù)量為1000×5×5個細胞,從計數(shù)好的細胞懸液中取出所需的細胞量和*培養(yǎng)基混勻,體積為200×5×5μl。
 
  3.統(tǒng)一鋪好后,待細胞*沉淀下來后,在顯微鏡下觀察各實驗組的細胞密度,如果密度不均勻,則固定一組,微調(diào)其他組細胞的量再次鋪板(如:發(fā)現(xiàn)NC組細胞較多,降低細胞量再次鋪板),放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
 
  4.從鋪板后開始,每孔加入10-20μl CCK-8溶液,如果每孔的培養(yǎng)基為100μl,則加入10μl CCK-8溶液,如果每孔的培養(yǎng)基為200μl,則加入20μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD 值的讀數(shù))。用加了相應量細胞培養(yǎng)液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照。
 
  5.在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時,對于大多數(shù)情況孵育2小時左右就可以了。
 
  6.用酶標儀測定在450nm處的吸光度(使用酶標儀之前要提前開啟10min預熱)測定完成后,保存數(shù)據(jù)。
 
  7.連續(xù)五天檢測,每天保持一樣的時間點加入CCK-8溶液,在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時間相同。
 
  注:若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定,吸光度不會發(fā)生變化。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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