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豚鼠外周血單個核細胞分離液說明書LDS1083

豚鼠外周血單個核細胞分離液說明書

【包裝規(guī)格】
200ml/瓶
【實驗前準備】
A．適用儀器
zui大離心力可達1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機
B．耗材

【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在20±2℃的條件下進行。
首先根據(jù)樣本量大小，分以下幾種情況：
一、使用15ml離心管時：
情況A：血液樣本量小于 3ml時，實驗方法如下：
1.取一支15ml離心管，加入3ml分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
情況B：血液樣本量為3-6ml時，實驗方法如下：
1.取一支15ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1000g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
二、使用50ml離心管時：
情況A：血液樣本量為6-10ml時，實驗方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1200g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
  8. 250g，離心10min。
9.重復6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
情況B：血液樣本量為10-20ml時，實驗方法如下：
1.取一支50ml離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
2.用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，650-110g，離心20-30min（注：根據(jù)血
液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件
需客戶自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過1200g）。
3.離心后，此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色單個
核細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個核細胞層到另一15ml離心管中，向所得離心管
中加入10ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
5. 250g，離心10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
8. 250g，離心10min。
9.重復6、7、8，棄上清后以0.5ml后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。
【注意事項】
1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在20±2℃的條件下進行。為獲得的實驗結(jié)果，
在取血2h內(nèi)進行實驗，血液存放時間越長，細胞分離效果越差。血液放置超過6h
后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
2.本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離
心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面
會變成毛面，影響細胞分離效果。
3.吸取過多的單個核細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的
粒細胞數(shù)量增加。
4.吸取過多的單個核細胞層上層溶液會導致血漿蛋白及血小板混雜。
5.如所實驗后細胞得率或活性過低，請上海研謹以尋求幫助，具體
詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
6.當血液樣本粘度過高需稀釋時，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號：
2010C1119）1:1稀釋混勻備用。注：不當?shù)南♂尫椒〞档图毎寐始盎钚浴Ｈ缪簶?/span>
  本經(jīng)過稀釋則分離過程中需適當降低離心力和離心時間。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期2年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實驗淋巴細胞提取率及純度均大于80%。
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。

 
【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1.所獲得淋巴細胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得淋巴細胞的鑒定方法
A.流式細胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)
注：上述技術(shù)方案詳情請登陸上海研謹生物公司搜索細胞分離、
純化、擴增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”，并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2.本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶可根據(jù)當?shù)厍闆r對離心條件進行適當調(diào)整。建議對離心條件進行調(diào)整時，恒定離
心時間，對離心轉(zhuǎn)速進行調(diào)整。
3.本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可
能出現(xiàn)紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù)，直至達到分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min為準。